shRNA对转基因猪的毒性研究

【摘要】RNAi指由双链RNA引起的细胞内靶mRNA特异性降解现象，属于转录后基因沉默机制。随着对RNAi机制研究的深入，人们发现shRNA与细胞内源miRNA在形成以及发挥功能机制上相似：均经Dicer等因子加工成siRNA；分别组装成沉默复合物miRISC和siRISC，进而发挥功能。一些研究发现，RNAi技术存在着潜在的毒副作用，包括非特异性免疫反应、脱靶效应、miRNA通路饱和等，这些负效应严重阻碍了RNAi技术的应用。在shRNA转基因克隆动物制备中，通过核移植操作使供体细胞发生重编程，产生的siRNA在胚胎发育过程中会被识别为自身成分，因此，shRNA对转基因动物是否存在毒性一直存在着争议。目前，研究人员已成功采用化学修饰和序列优化等措施避免了非特异性免疫反应和脱靶效应，而如何降低siRNA表达量、避免miRNA通路过饱和仍未解决，针对shRNA的设计原则及研究也不明确，因此筛选单拷贝、低表达量、高效抑制靶基因的shRNA序列，成为RNAi下一步研究的热点问题。本课题组前期研究发现，利用体细胞核移植技术制备的shRNA转基因克隆猪较其他克隆猪产仔数少、仔猪存活率低。为探究高表达shRNA是否是造成这一现象的原因，实验首先通过基因组PCR、微卫星分析、拷贝数检测试验证实，所获得的2种仔猪均为shRNA（shRNA-NS3-2和shRNA-NS5）转基因阳性克隆猪。为验证shRNA抗毒效果，分离培养仔猪尾尖成纤维细胞后，感染猪瘟病毒，间接免疫荧光检测结果显示，shRNA转基因猪在细胞水平能较好的抑制猪瘟病毒复制。Real-TimePCR法进一步检测了shRNA在转基因猪肝脏组织中的多拷贝、高表达，并且发现shRNA转基因猪肝脏组织的Dicer、Drosha等多个miRNA通路因子以及多个内源性miRNA表达异常。WesternBlotting结果发现miRNA通路关键因子AGO-2和Exportin-5的异常表达。这些数据都提示，高表达的shRNA竞争使用miRNA通路因子，引起体内miRNA通路因子及miRNA异常表达，shRNA转基因猪死亡率高等毒副作用。为降低RNAi技术的毒副作用，筛选单拷贝、低表达量、高效抑制靶基因shRNA序列，我们构建了荧光报告系统shRNA筛选平台。平台构建的shRNA筛选载体采用了Tet-on启动子调控shRNA的表达，在荧光蛋白的3’UTR区插入了shRNA的靶序列。实验通过包装逆转录病毒、感染报告细胞系、流式荧光报告检测，最终以细胞荧光衰减程度及不同抑制效率的shRNA参照载体量化shRNA的抑制效率，筛选出低拷贝表达、高抑制效率的shRNA备选序列。我们进一步验证了平台的可行性及高灵敏度，选取已知有效抑制猪瘟病毒复制的siRNA-N2、siRNA-NS5B序列，通过shRNA筛选平台检测验证，结果显示单拷贝条件下shRNA-N2抑制靶序列效率较强，而shRNA-NS5B抑制效率弱，同时证实了siRNA与shRNA序列设计原则的差异性。此平台灵敏度高、可有效筛选低拷贝表达、高抑制效率的shRNA序列，为下一步定点插入单拷贝shRNA的转基因动物研究奠定了基础。本研究证实高表达shRNA竞争使用miRNA加工运输和发挥功能的细胞组分，是造成shRNA转基因猪低出生率低和仔猪高死亡率原因之一，同时构建了高灵敏度的荧光报告系统shRNA筛选平台，为shRNA转基因克隆动物的研究提供了保障。
【作者】戴祯；
【导师】逄大欣；
【作者基本信息】吉林大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】RNAi；转基因；miRNA通路饱和；猪瘟；shRNA筛选平台；

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